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一种用于制备高产量活组织的新协议细胞：

如果动物组织样品超过50-100 mg（湿重），首先用Tissue Press（TP）、MicroMincer（MM）分散），或绞肉机（MG）。这些装置的半固体输出不需要悬浮在缓冲液或其他液体介质中，并且由活细胞的小聚集体组成。分散的动物组织的质地各不相同，从 TP 和 MM 的\"牙膏状”到 MG 的\"汉堡包状”。机械分散的组织聚集体现在具有大大增加的表面积，可以分解为单个组织。细胞by 对其细胞内基质进行酶消化。 [有关通过酶消化进行组织解离的经典方法的更多信息，请参阅 http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/basic.html 和 https://www.chiscientific.com/News1.aspx?type=3Links...组织解离技巧 (1)、(2) 和 (3)]。评论强调，在组织与蛋白水解酶一起孵育以消化将细胞固定在一起的蛋白质基质后，细胞分离的一个关键部分是研磨过程（例如，通过反复填充和排空软化的组织细胞聚集体来分离组织细胞聚集体）。用 10 ml 移液管以每秒约 3 ml 的速度消化组织，同时小心避免细胞悬浮液中出现气泡）。研磨的目的是尽量减少过度剪切引起的敏感细胞活力的损失。研磨速率和通过移液管的次数将取决于选择的组织，并且必须通过繁琐的过程来确定反复试验。

本议定书建议取消上述手动研磨过程。相反，研磨被在 6 毫米直径低密度塑料珠（可从 biospec Products 获得）存在下混合酶/组织混合物所取代。重要的是，这些塑料珠的密度与酶消化混合物相似。据推测，在消化过程中，组织与这些低密度珠子的碰撞将足够温和，以避免细胞活力丧失。在组织细胞内基质的酶消化过程中，细胞聚集体表面形成粘性凝胶状层。该层减少了添加的消化酶向其目标底物（细胞内基质的蛋白质）的扩散。在孵育过程中添加微珠并轻轻搅拌，组织碎片表面会被\"按摩”，凝胶层分散，消化速率增加，从而加快时间。ssue 解离并产生更高产量的活细胞。

为了最大限度地提高活细胞产量，必须避免剧烈搅拌和过度暴露于消化混合物中的气泡。对于后一个问题，在消化混合物中添加 Poloxamer-188 可能是一种重要的稳定剂（详细信息请参见 Narayanappa et. al., Biotechniques, V.67, No.3, p.98-109（2019 年 9 月） ）。

探索完善此珠子辅助方案以制备高浓度的实验变量活组织细胞的产量包括添加到消化混合物中的珠子数量、搅拌强度、孵育时间、通气效果和孵育温度的影响。对孵育温度的研究可能特别有趣。低孵育温度实际上可能会提高组织细胞的产量可行的单细胞。例如，众所周知，低温会物理性地改变附着力培养细胞与人造表面的固定点。这同样适用于\"细胞间”接触。虽然在 10 摄氏度下孵育含有搅拌珠的组织/酶消化混合物需要更多时间才能完成，但活细胞的比例可能会明显更高。

请通过 hop@biospec.com 联系 Tim Hopkins，获取塑料珠样品。